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Interceptación de la comunicación bacteriana: una alternativa a los antibióticos

IPac. - 2 de diciembre de 2011

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En el año 2006 el grupo de Biotecnología marina y acuicultura del departamento de Microbiología de la USC, que hasta entonces se había dedicado casi exclusivamente a biotecnología con microalgas en aspectos relacionados con la nutrición, decide abrir una nueva línea en sus investigaciones; se trata de la búsqueda de una vía alternativa a los antibióticos para el tratamiento de infecciones por bacterias en acuicultura a través de Quorum Quenching (interrupción de la comunicación bacteriana). Los pronósticos, en un principio esperanzadores, han dado lugar a resultados sorprendentes además de concluyentes. Así y tras la defensa de la tesis doctoral dirigida por Ana María Otero Casal, profesora de la facultad de Biología, y de la que es autor Manuel Romero Fernández, esta línea de investigación ha logrado el premio de Investigación 2010 de la Real Academia Gallega de las Ciencias, distintas publicaciones en revistas de impacto y dos patentes.

Ana Otero Casal explica en esta entrevista a IPac. en qué consiste esta nueva línea de investigación, los resultados obtenidos hasta el momento, las perspectivas futuras y sus implicaciones en el sector productor de acuicultura.

Ustedes están llevando a cabo una investigación que podría suponer un giro sustancial en la lucha contra determinados patógenos causados por bacterias. ¿En qué consiste?
A grandes rasgos de lo que se trata es de que si partimos de que muchas bacterias patógenas se coordinan comunicándose entre ellas mediante la producción de pequeñas moléculas señal en un proceso denominado Quorum Sensing (detección de quórum), si estas señales son eliminadas del medio, es decir, si cortamos la comunicación entre ellas,  lo que se conoce como Quorum Quenching (o interceptación del quórum) los patógenos se desorganizan y pierden su virulencia. Partiendo de esa premisa, nuestro trabajo se ha centrado en aislar diversas bacterias marinas capaces de degradar esas señales de comunicación bacteriana para utilizarlas en el tratamiento y prevención de patologías en el campo de la acuicultura, consiguiendo, de esta manera, un mecanismo alternativo a los antibióticos en la lucha contra las enfermedades en peces y moluscos.

¿En qué momento y por qué se deciden a abrir esta línea de investigación?
Comenzamos realmente a trabajar en esta nueva línea en el año 2006, aunque ya desde 2001 vislumbrábamos que la importancia de los fenómenos de comunicación bacteriana en patógenos en general podría tener un altísimo potencial en el campo de la acuicultura, un campo en el que no estaba trabajando nadie en España y con muy pocos grupos activos en el mundo. Era un tema enormemente atractivo, y pensando en las posibles y trascendentales implicaciones que podrían darse en acuicultura decidimos apostar y diversificar nuestra línea tradicional de trabajo, que es la biotecnología de microalgas.

¿Qué se conocía exactamente sobre el tema?
Remontándonos muy atrás, en los años setenta se descubre, en unas bacterias que producen luz, que éstas emitían de forma continuada unas pequeñas moléculas señal que liberaban al medio, llamadas autoinductores. El mecanismo es el siguiente: si la bacteria está sola esa molécula se aleja de la célula y no es detectada por sus sensores de quórum, pero cuando hay muchas bacterias se produce una acumulación de la señal que es detectada por los sensores permitiendo a las bacterias coordinarse para llevar a cabo acciones concertadas y empezar a expresar genes de forma organizada, en este caso producir luz. Si bien a este primer descubrimiento se le dio muy poca importancia, posteriormente, aunque sólo desde hace algo más de diez años, se ha sabido que, efectivamente, la mayor parte de las bacterias patógenas que tenemos en acuicultura utilizan este mecanismo para organizarse y atacar, no solo a nuestros peces, sino a plantas y animales, entre los que nos encontramos los humanos.

Bacterias bioluminiscentes del género Vibrio en las que se descubrió el mecanismo de comunicación bacteriana denominado Quorum Sensing. Las bacterias solo producen luz cuando hay un número suficiente para que esa luz sea efectiva para el calamar en el que viven como simbiontes.

¿En qué consiste?
La mayor parte de los patógenos, bacterias en este caso, que conocemos en acuicultura: vibrios, yersina, tenacibaculum, etc. producen  unas moléculas todas ellas de la familia de las Acil-homoserin-lactonas (AHL), que es la familia de autoinductores que les permiten atacar sólo cuando hay un número suficiente para vencer las defensas del “enemigo”. Si hay pocas bacterias, como señalaba antes, la señal se pierde, pero, cuando la concentración de señal es grande las bacterias deciden, en lenguaje coloquial, “atacar” de forma coordinada, esto es, van a expresar una serie factores de virulencia, que son los que van a hacer que el pez enferme. Por tanto, si las bacterias sólo “atacan” cuando se comunican, el objetivo, estaba, y está muy claro: hay que impedir esa comunicación.

En el año 2000, y esto fue uno de los hechos que nos dio a entender que ésta era una vía de gran potencial, se sabía que un alga roja australiana, con capacidad para evitar que las bacterias colonizasen su superficie, era capaz de interrumpir esa comunicación entre bacterias. Este efecto se ve claramente cuando los investigadores que descubrieron el fenómeno (Manefield y colaboradores) colocaban el alga sobre la superficie de una placa con la bacteria Chromobacterium violaceum, que sólo produce pigmento púrpura cuando tiene activos los canales de quorum sensing. Lo que se vio en ese caso fue que ese alga producía una molécula muy parecida a la molécula señal de la bacteria que se unía al receptor de la bacteria bloqueando la comunicación, se trataba de una furanona, que se probó en truchas en 2004 demostrándose que bloqueaba la infección por vibrios, aunque, como contrapartida, era altamente tóxica. También en el año 2004 se habían identificado ya algunas bacterias terrestres que degradaban la señal, la eliminaban enzimáticamente. Estos dos ejemplos representan las dos vías principales de interceptación de quórum, un mecanismo de lucha antimicrobiana que se ha denominado de forma genérica quorum quenching: el antagonismo (actividad inhibidora) por un lado, como en el caso de las furanonas, que, como decía, bloquean el receptor pero son altamente tóxicas, y otra vía era la de buscar bacterias que degradasen la señal, es decir que tuvieran actividad enzimática anti-AHL. Y ya en el año 2006, nos ponemos manos a la obra y decidimos buscar financiación para llevarlo a cabo.

¿Cómo se plantea el proyecto?
Como señalaba anteriormente, se conocían un par de bacterias terrestres con actividad enzimática, pero esas bacterias no sobreviven en el agua de mar y no son activas en ese medio, así que decidimos irnos al mar y buscar allí bacterias con actividad quorum quenching. No sólo en el mar, cerca de la costa y en mar abierto; sino que también nos fuimos a instalaciones de acuicultura de distinto tipo, y recolectamos algas para aislar bacterias de la superficie. Lo que conseguimos fue una colección de más de 600 aislados de bacterias, que probamos primero con bioensayos y después químicamente mediante HPLC-MS para determinar si teníamos actividad enzimática o actividad inhibidora. Nuestra primera sorpresa fue la cantidad de actividad que nos encontramos, esperábamos realmente que en el mar hubiese mucha más actividad que en el suelo, pero lo que hallamos fue realmente impresionante. En el caso de las bacterias de mar abierto, el 20% de las mismas tenían algún tipo de actividad quorum quenching y, en la superficie del alga, ese porcentaje ascendía al 40%; mientras que en el suelo sólo es del 2%. Por tanto, el mar es, efectivamente, una fuente inagotable de bacterias que pueden ayudarnos.

El alga roja Delisea pulchra genera un “halo de silencio” a su alrededor al producir una furanona que inactiva los sensores de quórum de las bacterias. En este caso, al depositarla sobre una placa de la bacteria Chromobacterium violaceum, la bacteria tiene bloqueado su sistema de quórum y no produce el pigmento violaceina.

FUENTE: Revista Microbiology con autorización de los autores (Manefield y colaboradores 1999).

De esas más de 600 bacterias, escogimos 20 por su potencial aplicación en acuicultura; esto es, con mucha actividad y, además, capaces de eliminar todo la gama de señales, es decir, poseedoras de una actividad de amplio espectro capaz de eliminar todas las señales de la familia de las AHL, que son las que usan la mayoría de los patógenos en acuicultura, independientemente de que fuesen moléculas de cola corta o larga. Todas las bacterias identificadas tienen capacidad enzimática, no detectamos ninguna con actividad inhibidora y algunas de ellas son cepas muy interesantes porque son especies no descritas hasta el momento. Fruto de ese trabajo, y con el apoyo de la Fundación Genoma España,  hemos conseguido patentar dos de estas cepas, la 20J (que ya está aprobada) y la 177 (en fase nacional).

¿Por qué se decidieron por estas dos?
La 20J daba una actividad muy fuerte y antes de publicar nada al respecto decidimos patentarla. Es buenísima, muy potente. Y para que se haga una idea de su potencial, los consorcios bacterianos marinos con actividad quorum quenching descritos recientemente en la bibliografía tardan, aproximadamente unas 48 horas en eliminar una de las señales más típicas, la C6-HSL, mientras que nuestra cepa tarda unas 8 horas en eliminar esa misma señal y solo 30 minutos en eliminar completamente otras señales como la C12-HSL. Se podría decir, con toda seguridad, que es lo más potente en el campo de quorum quenching que, a día de hoy, existe en los laboratorios de investigación. El problema con que nos hemos encontrado aquí ha sido con que esta bacteria está identificada molecularmente como Tenacibaculum (una palabra terrorífica para los acuicultores) aunque, realmente, es bastante distinta a esa bacteria: crece en medio distinto y es muy distinta bioquímicamente. La buena noticia es que a pesar de que la cepa viva es inmensamente activa, la célula muerta, el extracto celular, es casi igual de activo. Si se compara el enzima de la bacteria terrestre Bacilus, la primera descrita y de las más estudiadas, con el extracto celular de 20J, este último es 100.000 veces más activo y si, además, lo utilizamos en agua de mar, esa efectividad es un millón de veces superior.  En este momento estamos trabajando en la clonación de los genes responsables de esta actividad y lograr así un enzima puro con vistas a posibles aplicaciones farmacéuticas.

Ejemplo de bioensayo con la bacteria Chromobacterium violaceum para detectar la actividad Quorum Quenching. Las bacterias con actividad evitan la aparición del halo púrpura alrededor del pocillo. Los dos pocillos sin halo corresponden a la bacteria 20J.

Y con respecto a la cepa 177, la ventaja que tiene es que, además de ser muy activa, es una bacteria no descrita, con lo que no tiene nada que ver con ningún patógeno que conozcamos, y, por tanto, podríamos utilizarla viva en el medio de cultivo de nuestros peces y moluscos sin tener que recurrir a los extractos celulares. Seguimos trabajando con la 20J, seguimos con la 177 y estamos empezando también con las otras cepas que hemos seleccionado con la intención de quedarnos con cinco o seis.

Con respecto a la cepa  sobre la que más han trabajado, 20 J, ¿se ha realizado algún ensayo o experiencia con peces?
Empezamos con las primeras pruebas en el mes de mayo pero para realizar este tipo de ensayos requeríamos de un nuevo proyecto y nueva financiación. Ahora podemos decir que las pruebas de campo, o de concepto, esto es, cuando tienes un producto patentado y se quiere ver si realmente funciona, comenzarán de forma efectiva próximamente. Para ello esperamos contar con financiación del sector privado, que esperamos poder cerrar en las próximas semanas.

En principio, se centrarían en  las cepas 20J y la 177...
Sin dejar de trabajar con las otras, no centraremos más en éstas porque son las que están más protegidas en este momento. La prioridad es comprobar su efectividad in vivo y, sobre todo, y muy importante, definir la vía de administración. Cuando estamos hablando de peces grandes, la vía de administración lógica será el pienso y en el cultivo larvario esa vía será el agua. Y esto pensado siempre como una estrategia de prevención o contención. Esto es, si tú tienes un pez muy enfermo, con este mecanismo no va a sanar; es un mecanismo de contención que evitaría que enferme el resto de los peces de la instalación. Otra ventaja de este tratamiento, que se ha denominado antipatogénico, ya que el objetivo no es matar a la bacteria, si no evitar que ataque, es que es inespecífico. Una vez que se muere un pez, no se tiene que esperar los tres días que normalmente se tarda entre que lo mandas a los patólogos, saber de qué se trata y tomar medidas. Simplemente, al primer síntoma, podríamos administrar un pienso de bloqueo, de quenching de amplio espectro, y luego ya sabré de qué bacteria se trata. Por último, ya que el quorum quenching no mata a la bacteria, no se espera que genere resistencias, sobre todo cuando aplicamos la vía de la degradación enzimática de la señal.

¿Para cuándo se podrían obtener los primeros resultados?
No es fácil de prever. Esperamos tener los resultados de las primeras pruebas de campo en unos 18 meses. En tres años podríamos tener ya los resultados definitivos. Luego habría que introducir el producto en el mercado. Insisto en que estamos hablando de un antipatogénico, que sería una solución alternativa a los antibióticos, que en acuicultura, como todo el mundo sabe, no se pueden utilizar de manera indiscriminada, y donde la legislación es cada vez más restrictiva. Introducir un producto como éste, un antipatogénico, en el mercado animal no sería muy dilatado en el tiempo, podrían entrar por la misma vía por la que lo hacen los probióticos.

Bloquear las infecciones bacterianas a través de otras bacterias, no sólo es aplicable al mundo de la acuicultura…
Absolutamente. Las farmacéuticas han sido las primeras interesadas en el tema, aunque quizás se han decantado más por la búsqueda de sustancias químicas con actividad inhibidora que por la actividad enzimática en sí. Esta capacidad de interrupción de la comunicación bacteriana, desde luego, abre un campo inmenso, no sólo en la acuicultura, sino en muchos otros campos como la veterinaria o la medicina como alternativa o co-adyuvante a los antibióticos. De hecho, como comentaba, y aunque nuestro foco de atención es la acuicultura, como posible uso para a la industria farmacéutica estamos desarrollando compuestos purificados de los enzimas, para lo cual estamos clonando genes de quorum quenching de la cepa 20J; diré más, a día de hoy ya tenemos un candidato que, en un principio, tiene ya el gen responsable.

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